線粒體復(fù)合體Ⅲ試劑盒說明書

                                          微量法100管/96樣

注   意 ：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

線粒體復(fù)合體Ⅲ（EC 1.10.2.2）又稱CoQ-細胞色素C還原酶，廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中，是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分，負責(zé)把還原型CoQ的氫傳遞給細胞色素C，生成還原型細胞色素C。

測定原理：

與氧化型細胞色素C不同，還原型細胞色素C在550nm有特征光吸收，因此550nm光吸收增加速率能夠反映線粒體復(fù)合體Ⅲ酶活性。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：液體20mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：液體1.5mL×1支，-20℃保存；

試劑四：液體20mL×1瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×1支，-20℃保存；

試劑六：液體2.5mL×1瓶，-20℃保存；

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、   準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、   將勻漿600g，4℃離心5min。

3、   棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

4、   上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅲ（此步可選做）。

5、   步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次），用于復(fù)合體Ⅲ酶活性測定。

測定步驟：

1、  分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至550nm，蒸餾水調(diào)零。

2、  樣本測定

（1）工作液的配制：將試劑五轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、25μL試劑六和200μL工作液，立即混勻，記錄

550nm處初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

復(fù)合體Ⅲ活力單位的計算：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol 還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。

 復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T=615×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。

 復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=124×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。

復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.248×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2.35×10^-4 L；ε：細胞色素C摩爾消光系數(shù)，1.91×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。

b.使用96孔板測定的計算公式如下：

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol 還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。

 復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1230×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。

 復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=248×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol還原型細胞色素C定義為一個酶活力單位。

復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.496×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2.35×10^-4 L；ε：細胞色素C摩爾消光系數(shù)，1.91×10⁴ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。