脲酶（Urease， UE）測定試劑盒說明書

                                    微量法100管/48樣

注    意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

UE能夠水解尿素，產生氨和碳酸。UE活性與有機物質含量、全氮和速效氮含量呈正相關，反應了氮素狀況。

測定原理：

利用靛酚藍比色法測定脲酶水解尿素產生的NH₃-N。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、甲苯（不允許快遞）和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：粉劑×1瓶，臨用前加入9mL蒸餾水，充分溶解待用，4℃保存；用不完的試劑4℃保存；

試劑二：液體22mL×1瓶，4℃保存；

試劑三A液：液體×1支，4℃保存；試劑三B液：液體×1瓶，4℃保存；臨用前將A液倒入B液中混合，待用；用不完的試劑4℃保存一周；

試劑四：液體2mL×1瓶，4℃保存；

樣本的前處理：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、  分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至578nm，蒸餾水調零。

2、酶促反應

混勻，放入37℃水浴1h后，10000g 25℃離心10min，取上清液。

2、將上清液稀釋10倍（取0.1mL上清液，加入0.9mL蒸餾水）。

3、測氨量（在微量石英比色皿或96孔板中加入下列試劑）

充分混勻，室溫放置20min

混勻，于578nm處，蒸餾水調零，讀吸光值A，計算ΔA=A測定管-A對照管。每個測定管設一個對照管。

UE活力計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準條件下測定的回歸方程為y = 0.0915x +0.0373；x為標準品濃度（μg/mL），y為吸光值A。

1、血清（漿）UE活力的計算:

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘產生1μg NH₃-N定義為一個酶活力單位。

UE活力（μg/min/mL）＝(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反總÷V樣÷T=27.32×(ΔA -0.0373)

單位的定義：每天每g土樣中產生1μg NH₃-N定義為一個酶活力單位。

2、組織、細菌或細胞中1μg NH₃-N活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產生1μg NH₃-N定義為一個酶活力單位。

UE活力（μg/min/mg prot）＝(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反總÷(V樣×Cpr)÷T =27.32×(ΔA -0.0373) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘產生1μg NH₃-N定義為一個酶活力單位。

UE活力（μg/min/ g 鮮重）＝(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷T =27.32×(ΔA -0.0373) ÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘產生1μg NH₃-N定義為一個酶活力單位。

UE活力（μg/min/10⁴ cell）＝(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反總÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.0546×ΔA

10：稀釋倍數；T：反應時間，60min； V反總：反應體系總體積：0.3mL；V樣：加入反應體系中樣本體積，0.02mL；V樣總：提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL； W：樣本質量， g；500：細菌或細胞總數，500萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

標準條件下測定的回歸方程為y = 0.04575x +0.0373；x為標準品濃度（μg/mL），y為吸光值A。

1、血清（漿）UE活力的計算:

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘產生1μg NH₃-N定義為一個酶活力單位。

UE活力（μg/min/mL）＝(ΔA-0.0373) ÷0.04575×10×V反總÷V樣÷T=54.64×(ΔA -0.0373)

單位的定義：每天每g土樣中產生1μg NH₃-N定義為一個酶活力單位。

2、組織、細菌或細胞中1μg NH₃-N活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產生1μg NH₃-N定義為一個酶活力單位。

UE活力（μg/min/mg prot）＝(ΔA-0.0373) ÷0.04575×10×V反總÷(V樣×Cpr)÷T =54.64×(ΔA -0.0373) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘產生1μg NH₃-N定義為一個酶活力單位。

UE活力（μg/min/g 鮮重）＝(ΔA-0.0373) ÷0.04575×10×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷T =54.64×(ΔA -0.0373) ÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘產生1μg NH₃-N定義為一個酶活力單位。

UE活力（μg/min/10⁴ cell）＝(ΔA-0.0373) ÷0.04575×10×V反總÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.1092×ΔA

10：稀釋倍數；T：反應時間，60min； V反總：反應體系總體積：0.3mL；V樣：加入反應體系中樣本體積，0.02mL；V樣總：提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL； W：樣本質量， g；500：細菌或細胞總數，500萬。