脯氨酸脫氫酶（ Proline dehydrogenase，ProDH)試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                       微量法100管/96樣

注   意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

ProDH是存在于線粒體內(nèi)的催化脯氨酸降解的關(guān)鍵酶。脯氨酸是分布Z廣泛的一種滲透物質(zhì)，在脅迫條件下很多植物可以通過(guò)增加合成、減少降解而在體內(nèi)累積大量脯氨酸，降低ProDH活性對(duì)于調(diào)節(jié)滲透平衡、防止?jié)B透脅迫對(duì)植物造成傷害、清除自由基、保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有重要意義。

測(cè)定原理：

利用異硫氰酸甲酯檢測(cè)ProDH催化的脫氫反應(yīng)，600nm處吸光值的吸光值的變化反映酶活性的高低。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體2 mL×1支， 4℃保存；

試劑二：液體25mL×1瓶， 4℃保存；

試劑三：粉劑×1瓶， 4℃保存；臨用前加入4mL蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存；

試劑四：粉劑×1瓶， 4℃保存；臨用前加入4mL蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存；

試劑五：粉劑×4支，4℃保存；

粗酶液提?。?/span>

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g樣本，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿，1500g 4℃離心15min，取上清液于一支新的EP管中，加入一滴試劑一（用10μL的槍頭加入），渦旋混勻，冰浴放置30min后，16000g 4℃離心20min，取上清置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至600nm，蒸餾水調(diào)零。

2、  樣本測(cè)定

（1）混合液的配制：首先將試劑三和試劑四配成溶液（見(jiàn)試劑的組成和配制），臨用前根據(jù)用量按照試劑二（V）：試劑三（V）：試劑四（V）=2.4（mL）：0.3（mL）：0.3（mL）的比例充分混勻。（注意：現(xiàn)配現(xiàn)用，用多少配多少），置于30℃水浴5min；

（2）試劑五的配制：取試劑五一支，臨用前加入500μL蒸餾水充分溶解待用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入35μL樣本、15μL試劑五和150μL混合液，混勻，立即記錄600nm處初始吸光值A1和10min后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

ProDH活性計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中使600nm處吸光值變化0.01為一個(gè)

酶活力單位。

ProDH（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.01÷T =57.14×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中使600nm處吸光值變化0.01為一個(gè)

酶活力單位。

ProDH（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T =57.14×ΔA÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL； V樣：加入樣本體積，0.035mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中使600nm處吸光值變化0.005為一個(gè)

酶活力單位。

ProDH（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.005÷T =114.29×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中使600nm處吸光值變化0.005為一個(gè)

酶活力單位。

ProDH（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.005÷T =114.29×ΔA÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；V樣：加入樣本體積，0.035mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。